Um teste experimental capaz de detectar a resistência aos medicamentos usados no tratamento da infecção pelo HIV tem o potencial de fornecer resultados sobre a suscetibilidade fenotípica em poucas horas e com baixo custo, de acordo com uma pesquisa apresentada na 26a Conferência Internacional sobre Aids, realizada em julho no Rio de Janeiro.
“Nosso objetivo era saber se um ensaio de atividade enzimática conseguiria atingir a sensibilidade necessária para detectar, simultaneamente, a carga viral do HIV e a resistência aos antirretrovirais”, disse Dorothy Mims, mestre em ciências, doutoranda em bioengenharia e pesquisadora na área de infecções sexualmente transmissíveis (ISTs) e aids vinculada à University of Washington, nos Estados Unidos. “Com o nosso ensaio, conseguimos detectar até 10 moléculas de transcriptase reversa do HIV, o que corresponde a uma carga viral constante de aproximadamente 25 cópias de RNA/mL, além de identificar fenotipicamente a resistência a todas as classes de inibidores da transcriptase reversa. Acreditamos que essa abordagem rápida e barata possa aumentar significativamente o acesso ao rastreamento de resistência aos antirretrovirais.”
Segundo Dorothy, as opções de testes de resistência a medicamentos disponíveis atualmente são complexas, caras e demoradas, o que limita seu uso rotineiro, especialmente nos cenários de atendimento local. Os testes genotípicos analisam as sequências genéticas do HIV para identificar mutações associadas à resistência, mas levam vários dias ou semanas para serem processados e não associam diretamente uma determinada mutação à perda de suscetibilidade a antirretrovirais específicos, explicou ela. Já os testes fenotípicos conseguem avaliar a suscetibilidade a determinados agentes, mas exigem “semanas de cultura celular com um intenso trabalho manual para avaliar a replicação do HIV na presença de diferentes inibidores”, explicou.
Diante disso, a equipe de pesquisa recorreu aos ensaios de atividade enzimática, pois eles não exigem a realização de cultura celular e levam apenas algumas horas. O ensaio PERT, por exemplo, mede a atividade da transcriptase reversa com base na produção de DNA viral.
“No caso de uma enzima suscetível aos antirretrovirais, pouco DNA é produzido na presença de um inibidor de transcriptase reversa. Já com uma enzima resistente, produz-se DNA em abundância, mesmo com um inibidor presente”, disse Dorothy.
O ensaio PERT é uma versão modificada da reação em cadeia da polimerase (PCR) quantitativa da transcriptase reversa, um método tradicionalmente usado em testes de carga viral do HIV baseados em RNA, explicou ela. A diferença é que, no PERT, o RNA do HIV é substituído por um RNA que não é do HIV, e a transcriptase reversa padrão é substituída pela transcriptase do HIV.
“Isso já nos dá, logo no início, uma medida da carga viral do HIV com base na quantidade de transcriptase reversa viral. Porém, em seguida, também podemos adicionar o inibidor da transcriptase reversa à reação de síntese do DNA complementar e, com isso, obter uma medida da suscetibilidade a vários inibidores da transcriptase reversa”, disse ela.
Embora esses ensaios para detecção da atividade da transcriptase reversa já existam há mais de três décadas, os produtos atualmente disponíveis no mercado são utilizados apenas para a detecção de contaminação retroviral em sistemas de vetores virais. Sendo assim, os pesquisadores tiveram como objetivo desenvolver uma versão otimizada e atualizada do ensaio, além de avaliar sua utilização em testes para quantificação da carga viral do HIV e da resistência a antirretrovirais.
A pesquisadora apresentou vários exemplos da capacidade do ensaio diante de algumas mutações específicas.
“Com base na mutação M184V, podemos diferenciar a transcriptase reversa do HIV resistente da que é suscetível ao uso de lamivudina e trifosfato de entricitabina”, afirmou Dorothy. “Usando a mutação K65R, é possível identificar a resistência ao difosfato de tenofovir. Já no caso das mutações de resistência relevantes para os INNTRs [inibidores não nucleosídicos da transcriptase reversa], também podemos diferenciar cepas resistentes das suscetíveis à doravirina e à rilpivirina. Por fim, considerando o trifosfato de islatravir (o primeiro inibidor nucleosídico de translocação da transcriptase reversa [INTTR], aprovado em 2026 nos EUA e Japão), também conseguimos discernir entre a transcriptase reversa do HIV resistente e a suscetível por meio da mutação M184V, que confere uma baixa resistência ao medicamento.” Além desses achados, a pesquisadora também apresentou os resultados relacionados às mutações Y188L e K101P.
A Organização Mundial da Saúde (OMS) recomenda que os testes detectem até 20% de resistência em cargas virais na faixa de 1.000 a 5.000 cópias de RNA/mL. Todos os experimentos com o ensaio PERT detectaram resistência a inibidores da transcriptase reversa com uma carga viral de aproximadamente 2.500 cópias de RNA/mL e distinguiram frações de enzimas resistentes de até 10%. O custo dos reagentes por teste é de aproximadamente US$ 4, disse Dorothy, e o tempo de execução do ensaio é de cerca de duas horas.
“A vantagem desse teste de resistência é que ele não depende de uma tecnologia de sequenciamento cara, mas, sim, de ensaios enzimáticos para identificar a resistência a inibidores da transcriptase reversa. Isso permite a realização de testes em condições reais da prática clínica diária”, afirmou ao Medscape a Dra. Monica Gandhi, médica e professora de medicina especializada em HIV ligada à University of California, nos EUA.
O tempo de processamento de duas horas é quase próximo ao de um teste rápido, ressaltou ela, e o baixo custo é mais um ponto positivo, embora a médica tenha acrescentado que o ensaio ainda precisará passar por mais estudos em comparação com as plataformas tradicionais de sequenciamento antes de ser aprovado.
“Ainda assim, uma limitação importante desse ensaio precisa ser destacada desde já: ele fornece dados apenas de redução de suscetibilidade aos inibidores da transcriptase reversa”, disse a Dra. Monica.
“A comunidade que estuda o HIV está mais preocupada com a resistência aos inibidores da integrase, uma vez que a resistência ao antirretroviral de primeira linha dessa classe — o dolutegravir — está aumentando em todo o mundo. De forma geral, o dolutegravir pode ser usado em associação com o tenofovir e a lamivudina mesmo em casos de resistência aos inibidores da transcriptase reversa. Assim, a verdadeira utilidade clínica desse ensaio ainda precisa ser comprovada.”
O estudo foi financiado pelo Washington Entrepreneurial Research Evaluation and Commercialization Hub (WE-REACH) e pela Arnold and Mabel Beckman Foundation. A pesquisadora Dorothy Mims informou não ter conflitos de interesses. O pesquisador sênior Ayokunle Olánrewájú informou ser um dos fundadores da Ireti Biosciences, e ele e um outro coautor informaram ser inventores de uma patente registrada com base no ensaio PERT. A Dra. Monica Gandhi informou não ter conflitos de interesses.
